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內蒙環保管家告訴你什么是脊髓灰質炎病毒殺滅試驗?

2021-10-15

  脊髓灰質炎病毒殺滅試驗的主要目的是測量消毒劑滅活脊髓灰質炎病毒(Poliovirus、PV)所需的劑量,以驗證病毒污染物消毒的實際劑量。內蒙環保管家對脊髓灰質炎病毒殺滅試驗的試驗原理是用細胞感染法測量消毒劑作用前后(或實驗組和對照組)樣本中脊髓灰質炎的量,以細胞病變為判斷指標,確定每組病毒的感染滴度,計算消毒劑對脊髓灰質炎的滅活率。


  脊髓灰質炎病毒殺滅試驗分組。


  1)測試組。根據被測消毒劑對其他微生物的殺滅或滅活劑量的估計,設置合適的濃度和作用時間組(不少于1濃度和3作用時間),作用時間的設計不得少于30s。


  2)陽性對照組。用去離子水代替消毒劑,按照試驗組規定的步驟加入脊髓灰質炎懸液進行試驗培養,觀察脊髓灰質炎生長是否良好。


  3)陰性對照組。以不含脊髓灰質炎的完全培養基作為陰性對比,觀察所用培養基是否污染,細胞是否生長良好。


內蒙環保管家


  脊髓灰質炎懸液定量滅活試驗的操作程序。


  1)從液氮中取出冷凍試驗宿主細胞,在37℃溫水中迅速融化,用細胞維持液洗滌兩次后,轉移到10毫升完全培養基培養瓶中。逐日觀察細胞生長情況,用于消毒試驗。


  2)取出低溫冷凍脊髓灰質炎-1毒株,37℃水浴融化,用細胞維持液稀釋10倍,然后接種到含有單層細胞的細胞瓶中,放入37℃溫箱中,與細胞吸附生長。每天觀察病變,當3/4細胞發生病變時,收獲病毒。收獲時,取出培養液,用超聲波或反復凍融破碎宿主細胞,盡快離心,將含病毒的上清液按每管1.Oml分裝在無菌離心管(1.5ml)中,冷凍保存在-80℃備用。


  3)取待測消毒劑,用滅菌硬水稀釋至所需濃度的1.25倍,備用于20℃±1℃水浴。


  4)取100μ1有機干擾物與100μ1病毒原液混合,在20℃+1℃水浴中作用5min,加入0.8ml待檢消毒劑,立即混合并記。在規定的時間內,立即取出0.1ml,加入中和劑混合;或采用合格的除藥方法。


  5)在陽性(病毒)對照組試驗中,用無菌去離子水代替消毒劑。


  6)每組分別測量病毒滴度,可采用終點稀釋法或噬斑法。


  7)試驗重復三次。


  8)終點稀釋法的操作步驟:首先用細胞維持培養液對滴定樣本進行10倍系列稀釋,然后在96孔培養板上滴定每個稀釋樣本中殘留的病毒量,每個稀釋度為4孔(每個孔應長滿單層宿主細胞),37℃放置1h~2h,確保殘留病毒全部吸附在細胞上。取出培養板,更換細胞維持培養液。繼續放入二氧化碳培養箱(37℃,5%CO),在顯微鏡下逐日觀察細胞病變,連續觀察3d,逐孔觀察記錄細胞病變。終點稀釋病毒感染滴度的計算:表示半數細胞感染劑量。


  9)噬斑法的操作步驟:首先用細胞維持培養液稀釋滴定樣本10倍,然后接種到細胞培養瓶中,滴定每個稀釋樣本中殘留的病毒量。在接種細胞之前,將生長致密的單層細胞中的培養液傾出,加入1ml待測樣品,放置37℃吸符1h~2h,傾出樣液,加入含有0.8%瓊脂的細胞維持液3m1,冷卻后翻轉細胞瓶,放置37℃培養48h~72h。然后每瓶細胞加入2m1甲醛溶液固定幾分鐘,用自來水沖洗,用結晶紫溶液染色幾分鐘,沖洗后計數。細胞瓶內圓形不著色的透明區域為蝕斑單位,計算每毫升樣品中的病毒含量:pfu/m1=平板平均蝕斑×稀釋倍數。為便于計數,病毒蝕斑一般控制在每個細胞瓶10pfu~30pfu。


  計算脊髓灰質炎病毒殺滅試驗。


  滅活對平均值按以下類型計算陽性(病毒)對照組平均病毒感染滴度為No,實驗(消毒)組平均病毒感染滴度為Nx。


  平均滅活值=logNo-logNx。


  脊髓灰質炎病毒殺滅試驗的評價規定。


  1)脊灰病毒滅活試驗可用于評估器械、餐具、物體表面和皮膚用化學消毒劑對病毒的滅活效果。病毒滅活滴度應達到4個對數值。


  2)正常情況下,3次試驗的平均滅活對值≥4.00,可判定為對脊髓灰質炎病毒污染物進行消毒的實驗室試驗。同時,陽性對照組病毒滴度對數值應在5~7之間。


  脊髓灰質炎病毒殺滅試驗注意事項。


  1)操作人員應具備基本的病毒學實驗經驗,盡量使用移液器和無菌一次性吸頭。


  2)在殺菌試驗中,每次應設置陽性對照。


  3)使用病毒載體進行試驗的,可參照上述懸液定量試驗程序,并按照病毒學原理進行適當修改。


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